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抗酒石酸酸性磷酸酶染液說明書

（tartrate-resistant acid phosphate stain, TRAP stain）

產(chǎn)品用途：

存在于正常人肺泡巨噬細胞等部位的TRAP和存在于細胞白血病人脾臟的TRAP均在細胞濾泡中，并不釋放入血液，血液中TRAP絕大部分來源于破骨細胞。因而測量血液中TRAP可以了解破骨細胞的功能狀態(tài)。本染液可用于石蠟切片、血液及骨髓涂片、細胞爬片、冰凍切片中的破骨細胞染色。

檢驗原理：

在酸性的緩沖液中，細胞內(nèi)酸性磷酸酶催化底物水解，其生成物進而與一種穩(wěn)定的重氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性的偶氮染料沉淀，當(dāng)?shù)孜镏写嬖诰剖釙r，該反應(yīng)只出現(xiàn)在特異性細胞中。

儲存條件及有效期：

本試劑盒室溫密封保存，有效期3個月。所有應(yīng)用液配置后要立即使用，當(dāng)天一次用完。

所需儀器：

光學(xué)顯微鏡、染缸、玻片、滴管、秒表、記號筆等。

試劑組成及配制：

簡明試劑組成表

具體試劑配制及操作：

一、固定液：液體，40ml×1瓶

新鮮血涂片、細胞涂片或爬片、冰凍切片用固定液固定5～10min。石蠟包埋的切片經(jīng)脫臘后不需要再固定。

二、底物反應(yīng)液(一)、(二)、(三)、(四)的組成及配制：

●底物反應(yīng)液(一)組成及配制

組成：(1)A粉×1支    (2)B液500ul×1支

(3)C粉×1支    (4)D液500ul×1支

配制：臨用前將B液用移液器吸入A粉中充分溶解配成甲液，備用

再將D液移液器吸入C粉中充分溶解配成乙液，備用

zui后將甲液與乙液混合成底物反應(yīng)(一)，備用

●底物反應(yīng)液(二)組成及配制：

組成：(1)E粉×1支    (2)F500ul×1支

配制：臨用前將底物反應(yīng)液二的F液移液器吸入E粉中充分溶解配成底物反應(yīng)液(二)，備用。

●底物反應(yīng)液(三)：G液1ml×1支，備用

●底物反應(yīng)液(四)組成及配制：

組成：(1)H粉×1支    (2)I液500u l×1支

配制：臨用前將I液移液器吸入H粉中充分溶解配成底物反應(yīng)液四，備用

底物孵育液的配制：

染色缸染色孵育法：

①將底物反應(yīng)液(一)、(二)、(三)、(四)的備用液混合并充分混勻，

②先在染缸內(nèi)加30 ml蒸餾水，37℃水浴10分鐘，

③將底物反應(yīng)液(一)、(二)、(三)、(四)依次加入已預(yù)溫的蒸餾水中，

④然后將樣本玻片固定,水洗后還末*干前,，立即將樣本玻片放入已準(zhǔn)備好的反應(yīng)孵育液中，避光孵育60分鐘。

三：復(fù)染液：蘇木素液，10ml×1瓶

甲基綠液，10ml×1瓶

孵育完后，取出水洗1分鐘，在玻片尚未*干之前進行復(fù)染。

可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘，或用甲基綠復(fù)染2～3分鐘，兩者取其一

樣本染色前處理及染色：

血涂片及骨髓涂片

1、推片：取全血或骨髓3微升左右置載玻片上，將推玻片保持與載玻片30度角，置于血滴正前方，稍往后移與血滴接觸，血滴沿推片下緣散開，再勻速沿載玻片平面平穩(wěn)向前滑動，至血液鋪完血膜為止。滿意效果為不太薄，以免細胞太少，也不要太厚，以免太重疊。

2、涼干：使涂片在空氣中自然涼干，再放入本試劑盒中的固定液內(nèi)固定2~3分鐘，水洗約30~60秒。

3、一定注意水洗后不要太干時放入底物液中孵育60分鐘（太干后染色效果欠佳）。

石蠟切片

1、二甲苯中脫蠟5~10分鐘。再換用新鮮的二甲苯，脫蠟5-10分鐘。

2、無水乙醇5分鐘。再90%、70%乙醇各2分鐘。

3、水合：蒸餾水2分鐘。

冰凍切片

1、回溫：將預(yù)先制好的并保存在-20℃冰箱中的冰凍切片放置到切片架上回溫^【注】 約5-10分鐘。

【注】：1）可放到37℃孵箱中進行回溫;

       2）在37℃水浴箱中放置一個小盒子，再將從冰箱中取出的切片架放到小盒當(dāng)中，目的是讓冰凍切片回溫到37℃。

2、水合：將回溫好的切片，水中浸泡1~2分鐘。

注意事項：

1、如樣本為骨片的石蠟切片，要注意不可用硝酸脫鈣，酸脫鈣的方法對蛋白質(zhì)（酶類）傷害較大，從面影響特異性酶染色，會使細胞中的特異性酶失活，導(dǎo)致酶不能跟底物結(jié)合，從而導(dǎo)致染色失敗。建議使用抗酒石酸酸性磷酸酶的試劑進行脫鈣，本公司有售，咨詢。

2、用底物孵育液進行孵育時要注意避光。

染色結(jié)果：

陽性反應(yīng)為鮮紅色或深紅色顆粒，定位胞漿。